Real time PCR

يعد تحليل PCR – Real Time PCR / أحد أكثر الطرق دقة لتحليل التعبير الجيني. هذا يعني ، في ظل ظروف معينة ، أن التعبير عن جينات معينة في الخلية سيزداد أو ينقص ، أو سيبقى دون تغيير. قبل Real Time PCR ، كانت الطرق الأكثر شيوعًا لتحديد مستويات التعبير الجيني هي:northern blotting، RNase protection assays، endpoint reverse transcription (RT) PCR. تم استخدام RT-PCR أكثر من الطريقتين الأخريين بسبب ملاءمة الطريقة والحاجة إلى تقليل RNA. ومع ذلك ، مع هذه الطريقة ، لا يمكن ملاحظة مستويات التعبير الجيني إلا في نهاية التفاعل وعن طريق الرحلان الكهربائي لمنتج PCR على هلام الاغاروز. لذلك ، يمكن أن يكون RT-PCR أكثر فائدة لمعرفة وجود أو عدم وجود جين معين. في الواقع ، هذا الاختبار نوعي أو شبه كمي. لذلك ، لا يمكن التحقيق في التعبير عن جين معين كميًا باستخدام طريقة RT-PCR. لهذا السبب ، كانت هناك حاجة إلى طريقة أخرى کمیة تمامًا.

في الواقع ، يعتبر Real Time PCR هو نفسه PCR ، مع اختلاف أنه في Real Time PCR ، يتم تحديد التضخيم وزيادة عدد نسخ RNA أثناء التفاعل باستخدام مواد الفلورسنت. بهذه الطريقة ، في هذه الطريقة ، يتم استخدام المواد التي تظهر متى تتم كل دورة من التفاعل ، وبواسطة هذه ، يمكن التحقق من التعبير الجيني بدقة وكمية. وفقًا للمحتويات المذكورة ، يعد وجود عنصر التحكم (بمعنى الخلية بدون أي تغييرات مطبقة) ضروريًا في إجراء هذا الاختبار.

مزايا Real Time PCR:

• قياس عدد نسخ RNA للجين في مرحلة البدء وتحديد أصغر فرق في مستوى التعبير بين العينات
• لاحظ الزيادة التدريجية في منتجات PCR أثناء التجربة
• لا حاجة للرحلان الكهربائي لجيل الاغاروز والقضاء على احتمالية التلوث في هذه المرحلة
  
  

المواد اللازمة للاختبار

۱-طقم استخراج (Total RNA)

۲-طقم إنتاج cDNA

۳-Maste Mix Real Time PCR kit

۴-جهاز Thermo cycler

 

خطوات اختبار REAL Time PCR

• استخراج RNA

الخطوة الأولى في إجراء اختبار Real time PCR هي استخراج RNA ، والتي تختلف باختلاف نوع العينة. بشكل عام ، يمكن استخراج RNA بالطريقتين التاليتين:

• طرق الاستخراج العضوية باستخدام كاشف التريازول وكاشف الكيازول و RNA STAT-60T والطرق المعتمدة على ملح الجوانيديوم.
• مجموعة متنوعة من طقم عزل RNA ذات الطور الصلب متوفرة تجارياً من شركات مختلفة.

من المهم أن يتم استخراج RNA من جميع العينات بنفس الطريقة. إذا لم يتم اختبار RNA المستخرج على الفور ، فيجب تخزينه في ثلاجة – درجة20 لمدة شهر واحد ولفترة أطول في ثلاجة – درجة80.

يمكن أن تشير نسبة الامتصاص البالغة 280/260 من الطول الموجي RNA المستخرج إلى جودة الاستخراج. إذا كانت هذه النسبة 1.8 ، فإنها تشير إلى جودة جيدة لاستخراج RNA.

• إجراء Reverse Transcription

لإجراء Real Time PCR ، سيكون من الضروري صنع cDNA من RNA. من أجل صنعها ، صنعت مجموعات مختلفة من قبل الشركات ، التي أساسها هو نفسه. تم استخدام إنزيم MMLV ، وهو إنزيم Reverse Transcription ، في جميع هذه الطقم. تشمل المواد الأخرى المستخدمة في إنتاج (CDNA) مادة Random hexamer أو Oligo dT ، والتي تعمل بمثابة مادة أولية للإنزيم المقابل. بعد إضافة المواد المذكورة أعلاه بالتركيز الذي تحدده الشركة المصنعة ، نضع التفاعل في آلة PCR عند درجة حرارة ووقت محددين تحدده الشركة المصنعة أيضًا. من أجل إجراء تفاعل Real Time PCR ، من المهم الإشارة إلى أنه يجب استخدام RNA لجميع العينات بنفس المقدار بالضبط لإعداد cDNA. لأن هذا الاختبار يجب أن يُظهر زيادة في تعبير mRNA لجين معين بنفس كمية RNA.

• التحكم الداخلي

عند إجراء اختبار Real Time PCR ، بالإضافة إلى الجينات المستهدفة لتحديد مستوى التعبير ، يجب تضمين جين آخر كجين متراکم. تتمثل مهمة هذا الجين في إظهار صحة إنتاج cDNA ، ونقاء RNA الذي تم الحصول عليه ، وصحة اختبار PCR وأيضًا لتطبيع التعبير عن الجينات الأخرى. لذلك ، قبل القيام بأي شيء ، يجب تصميم primer (أو مأخوذة من المقالات و البحوث) وتصنع لجميع الجينات المختبرة. في كل تفاعل PCR ، يكون وجود هذه المواد مطلوبًا: إنزيم بوليميريز DNA (يسمى Taq) ، بافرmgcl2 ، dNTP ، primer وأخيراً cDNA.

فيما يلي مثال على كيفية إجراء اختبار:

في هذا الاختبار ، تم استخدام جهاز Thermo Cycler من شرکة ABI وطقم Master Mix من نفس الشركة. في كل خط خلية تم اختباره (كل من عينة التحكم وعينة الاختبار) ، تم وضع عينتين مكررتين لكل جين لضمان صحة الاختبار. كانت كمية المزيج الرئيسي لكل تفاعل 10 ميكرولتر ، و primer 1 ميكرولتر (كل من primers الأمامية (Forward) والخلفية (Reverse)) والماء 6 ميكرولتر. تم بهذه الطريقة أولاً تحضير أنبوب يحتوي على مادة أولية ، ماء ، Mester Mixلكل جين. بعد ذلك ، تم نقل 18 ميكرولتر من الخليط الناتج في أنابيب تفاعل وأخيرًا تمت إضافة 2 ميكرولتر من cDNA المركب إلى كل أنبوب تفاعل.

تم ضبط جهاز Thermo Cycler بحيث تظل درجة الحرارة عند 95 درجة لمدة 15 دقيقة. هذه الخطوة ضرورية لتفعيل إنزيم DNA Polymerase. ثم تم تطبيق 40 دورة مع تغير درجة الحرارة لمدة 15 ثانية عند 95 درجة مئوية ، ودقيقة واحدة عند 60 درجة مئوية على الجهاز.

• سيطرة سلبية

تجدر الإشارة إلى أنه في جميع الاختبارات التي تم إجراؤها ، سيتم إجراء تفاعل زائد لكل جين ، والذي يحتوي على جميع المواد في تفاعل PCR باستثناء cDNA. الحاجة إلى إجراء هذا التفاعل هو التحقق من عدم وجود تلوث في العينات وعدم وجود تفاعلات مثل primer Dimer في الاختبار.

مصادر الخطأ:

1- عدم استخلاص RNA الصحيح
2- عدم وجود نقاء كافٍ من RNA
3- عدم تصنیع cDNA
4- خطأ في إضافة مواد PCR
5- لم تتم معايرة جهاز PCR
6- تلوث في أداء كل خطوة من خطوات العمل
7- عدم تصميم Primers المناسبة والمحددة
8- وجود تلوث خلوي DNA

التحليلات الكمية في Real time PCR

هناك طريقتان رئيسيتان للتحليل الكمي Real time PCR:

• طريقة المنحنى القياسية (مقارنة مطلقة):

في هذه الطريقة ، يتم استخدام عينة من RNAأو DNA بتركيز معين لرسم منحنى قياسي. يتم تحديد تركيز RNAأو DNA القیاسی باستخدام مقياس طيف ضوئي (nm260) ثم يتم تحويله إلى عدد النسخ بناءً على الوزن الجزيئي للعينة. يمكن شراء معايير تركيز الجينات المعروفة تجارياً ، على الرغم من أنها باهظة الثمن. من العينات القياسية ، نحدد سلسلة من التصحيحات ونجمعها مع العينة المستهدفة في جهاز Real-time PCR. وباستخدام Ct الذي تعطينا جهاز إياه لكل تخفيف ، نرسم منحنى حيث X هو التخفيف أو عدد نسخ الجين و Y هو إذا كان CT ، فإن الرسم البياني الذي تم الحصول عليه هو رسم بياني خطي ، والذي يتم الحصول عليه أيضًا عن طريق وضع رقم العينة المستهدفة في الرسم البياني للتركيز أو رقم نسخه. على نحو مفضل ، يجب أن يكون طول القطعة القياسية مساويًا لطول القطعة المستهدفة.

• طريقة المقارنة النسبية:

تستخدم المعايير الداخلية للقضاء على تقلبات قيم RNA المدخلة في التفاعل وأخطاء الأجهزة والشخص. يجب أن يكون لهذه المعايير تعبير ثابت في جميع الأنسجة ويجب ألا يغير اختبارنا تعبيرها مقارنة بعينة التحكم. لهذا الغرض ، يتم استخدام جينات بيتا أكتين و GAPDH. تسمى هذه الجينات Housekeeping. يكون التعبير عن هذه الجينات مستقرًا ، ومن خلال مقارنة العينة المعالجة بتحکم والرقابة الداخلية ، يمكن ملاحظة الانخفاض أو الزيادة في التعبير.

• الكشف عن polymorphism عن طريق Real time PCR

يتيح لنا استخدام هذه التقنية تحديد كمية المناطق متعددة الأشكال ل DNA أو تحديد النمط الجيني ل Single nucleotide polymorphism (SNPS). يمكن المراقبة المتزامنة لعملية التكاثر وتحديد التركيب الوراثي باستخدام Hybridization probes وتحليل منحنى الذوبان. تم الكشف عن طفرة نقطية عن طريق تحليل منحنى الذوبان.

سوف يكون درجة الحرارة الحرجة Tm التي يصبح فيها DNA أحادي الجديلة هي مؤشر على وجود أو عدم وجود طفرة.

يتم تحضير probes محدد للمنطقة المتحولة. عند درجة حرارة منخفضة ، يرتبط probe بمناطق غير محددة ومع زيادة درجة الحرارة ، يصبح probeأكثر تحديدًا. نقوم بتحليل منحنى الذوبان الناتج عن هذا التفاعل لمعرفة الوجود أو الغياب من الطفرة.