تقييم خلايا Apoptotic و necrotic بواسطة طريقة تلطيخ Annexin V-FITC / PI

تقييم خلایا (Apoptosis and Necrosis) بواسطة طريقة تلطيخ Annexin V-FITC / PI

تحليل خلایا (Apoptosis and Necrosis) هو طريقة للتحقيق في آلية موت الخلايا بعد العلاج بمواد وأدوية مختلفة. في هذا التحليل ، يتم حقن الخلايا في جهاز قياس التدفق الخلوي بعد العلاج بالمواد المرسلة ويتم تحديد آلية الموت من خلال اختبار تلطيخ Annexin V-FITC / PI. للتعرف على الطريقة المناسبة ، من الأفضل أولاً التعرف على موت الخلايا المبرمج والنخر(Apoptosis and Necrosis). موت الخلايا المبرمج هو عملية منظمة للغاية لموت الخلايا والتي لا تلعب فقط دورًا في التشكل النمائي ، ولكنها تتحكم أيضًا في عدد الخلايا وموت الخلايا التالفة. لذلك ، يلعب موت الخلايا المبرمج دورًا مهمًا في قمع الورم.

قد يُعتقد أن موت الخلايا البشرية ليس ظاهرة جيدة. بشكل عام ، هذا الافتراض، على سبيل المثال ، في حالة الخلايا التي تضررت بسبب الإصابة، صحیح. ومع ذلك ، من المهم أن تموت بعض خلايانا في بعض الأحيان! بالطبع ، ليس بشكل عشوائي أو عن طريق الصدفة ، ولكن في عملية ذكية وخاضعة للسيطرة الكاملة. على سبيل المثال ، خلال الفترة الجنينية ، هناك طبقة بين الأصابع ، والتي تختفي لاحقًا بسبب موت الخلايا المبرمج التلقائي. أو عندما تتلف خلية ما ، فإن موتها المبرمج ينقذ الجسم بالفعل. التوازن بين نمو الخلايا والتمايز وموت الخلايا المبرمج يؤثر على العدد النهائي للخلايا في الجسم ، والتنظيم غير الطبيعي لهذه العمليات يمكن أن يتسبب في نمو الأورام. موت الخلايا المبرمج هو آلية رئيسية لقمع الورم في الجسم ، حيث يقضي على الخلايا ذات الضرر الواسع في الحمض النووي (DNA) والسرطان المحتمل. تكون عملية موت الخلايا المبرمج منظمة ومنتظمة ، حيث تُترك بقايا قليلة من الخلية السابقة وراءها. تعتبر القدرة على تحفيز موت الخلايا المبرمج في الخلايا السرطانية خطة إستراتيجية مهمة لعلاج السرطان. يتم دعم هذه القضیة من خلال حقيقة أن العلاج الكيميائي التقليدي الناجح يعمل عن طريق تحفيز موت الخلايا المبرمج.

هناك العديد من آليات الموت في جسم الإنسان ، اثنان منها هما Apoptosis (موت الخلايا المبرمج) و Necrosis (الأنسجة الميتة) مهمان للغاية. على عكس موت الخلايا المبرمج، في النخر لا تموت الخلايا بطريقة مبرمجة. على سبيل المثال ، قد تتفكك بسبب السموم الكيميائية أو الحروق أو الإصابات الجسدية. الاستجابة الالتهابية لنظام الجسم لها عيب أساسي في النخر. نتيجة للنخر ، يتم سكب المركبات الموجودة داخل الحويصلات الخلوية في الخلية. أيضًا ، يتم التخلص من غشاء الخلية التالف والمحتويات داخل الخلايا من مسام الغشاء وتسبب استجابة التهابية حول الأنسجة التالفة. عملية موت الخلايا المبرمج مختلفة تمامًا. بعد إرسال الإشارة وبدء العملية ، يتم تجزئة مكونات الخلية إلى أجزاء صغيرة. يظهر تشكيل هذه الأجزاء في الشكل أدناه.

يلعب دورًا مهمًا جدًا في سرطان الموت المبرمج. عندما يتلف الحمض النووي للخلية ، يتم التعرف على مشكلة الخلية بشكل عام من قبل الخلية نفسها ، ثم تقوم نواة الخلية بإصلاح الضرر من خلال عمليات الإصلاح. ولكن إذا كان لا يمكن إصلاحه ، فإن الخلية تصدر أمر الموت الخاص بها وتدخل في عملية موت الخلايا المبرمج. نتيجة لذلك ، لا يتم نقل الحمض النووي التالف إلى الخلايا الأخرى والجيل القادم. في السرطان ، عن طريق إضطراب عملية موت الخلايا المبرمج ، تنتقل الطفرات إلى الجيل التالي من الخلايا. اليوم ، تم تصميم الأدوية بطريقة تؤدي إلى إحياء عملية موت الخلايا المبرمج والموت المبرمج للخلايا السرطانية.

من أجل تقييم الخلايا المبرمجة ، توجد اختبارات مختلفة ، كل منها يفحص خاصية معينة للخلايا Apoptosis أحد الاختبارات الرئيسية لتحديد الخلايا المبرمج هو استخدام تقنية قياس التدفق الخلوي وتلطيخ Annexin V-FITC / PI . باختصار ، في هذه الطريقة ، تلطخ الخلايا المبرمجة وتحسب بسبب ارتباط فوسفاتيديل سيرين على سطح الخلية بـ Annexin المترافق مع FITC . من ناحية أخرى ، الخلايا الميتة ملطخة بصبغة PI. لذلك ، يمكن حساب النسبة المئوية للخلايا المبرمج والنخرية بسهولة.

يتم عدم تناسق دهون غشاء البلازما في الخلايا الحية بواسطة flippases. Flippases عبارة عن بروتينات غشائية تنقل جزيئات الدهون من طبقة غشاء إلى أخرى. عادة ، يحتوي الغشاء الخارجي على السفينغوميلين والفوسفاتيديل كولين ، والغشاء الداخلي يحتوي على فوسفاتيد إيثانول أمين وفوسفاتيديل سيرين ، والموجودين في الجزء السيتوبلازمي. بعد حدوث موت الخلايا المبرمج وتفعيل الكاسبيز ، يصبح هذا التوزيع غير طبيعي وينتقل الفوسفاتيديل سيرين ، الموجود عادة في الغشاء الداخلي ، إلى الغشاء الخارجي. يعتبر نقل الفوسفاتيديل سيرين من الغشاء الداخلي إلى الغشاء الخارجي بمثابة المراحل الأولى لموت الخلايا المبرمج. أظهرت الأبحاث أن Annexin V يرتبط بشكل خاص بالفوسفاتيديل سيرين في وجود الكالسيوم. باستخدام Annexin V المسمى بالبيوتين و FTTC ، يتم تسهيل بدء عملية موت الخلايا المبرمج عن طريق فحص فسفاتيديل سيرين في الغشاء الخارجي للخلية. من أجل تحديد كمية الخلايا المبرمجة الموجبة في Annexin ، يتم استخدام تقنية قياس التدفق الخلوي ، في هذه التقنية ، يتم فحص الخلايا الفردية المعلقة. في الخلايا السليمة ، لا يمكن ربط Annexin الخامس بالسطح الخارجي للغشاء ، ولكن في الخلايا الميتة ، حتى لو لم يحدث الموت المبرمج ، لأن سلامة الغشاء قد تم إتلافها ، وفي هذه الحالة ، يرتبط الملحق الخامس بالفوسفاتيديل سيرين و يجعل الخلايا Annexin إيجابية. من أجل تجنب الأخطاء في التجربة ، يتم استخدام صبغة بروبيديوم يوديد (PI) مع Annexin ، والذي لا يمكن أن يمر عبر غشاء الخلايا الحية. نتيجة قياس التدفق الخلوي هو جدول منازل الأربعة من 4 مناطق. هذه المناطق موضحة في الشكل أدناه.

• المنطقة 1: Annexin منطقة Annexin V – / PI – يتم وضع الخلايا الحية في هذه المنطقة.
• المنطقة 2: Annexin V + / PI – توجد خلايا موت الخلايا المبرمج في هذه المنطقة.
• المنطقة 3: Annexin V + / PI + في هذه المنطقة ، يتم وضع الخلايا الميتة إما عن طريق موت الخلايا المبرمج أو من خلال النخر. تسمى هذه المنطقة بالاستماتة(Apoptosis) الثانوية المتأخرة.
• المنطقة 4: Annexin V – / PI + ، توجد الخلايا الميتة في هذه المنطقة (المنطقة البيضاء في الشكل).

جمیع التحلیلات