الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء (HPLC) هي إحدى تقنيات الفصل الشائعة في العديد من العلوم. في هذه المقالة ، تم ذكر تاريخ الكروماتوغرافيا وشروطه وعلاقاته أولاً ، ثم تم ذكر طريقة اختيار الجهاز ومعلمات المختبر من أجل إجراء فصل فعال. معلمات مثل اختيار نوع العمود واختيار المرحلة المتنقلة التي تعتمد على قطبية التحليل أو اختيار الكاشف المناسب الذي يعتمد على التركيب والخصائص الكيميائية للعينة ؛ وأخيرًا ، تم ذكر طريقة التحليل الكمي والنوعي للكروماتوجرام.

تتضمن هذه المقالة العناوين التالية:

1- مقدمة وتاريخ الكروماتوغرافيا
2- مفاهيم أساسية في الكروماتوغرافيا
3- كروماتوغرافيا سائلة عالية الأداء
1-3- المرحلة الثابتة والمرحلة المتنقلة
2-3- مكونات وأجزاء مختلفة لجهاز HPLC
4- المعلومات التي تم الحصول عليها من الكروماتوجرام
1-4- التطبيقات النوعية
2-4- التحليل الكمي
1-2-4- الطريقة القياسية الخارجية (External Standard)
2-2-4- طريقة الزیادة القياسية (Standard Addition)
3-2-4- المعيار الداخلي (Internal Standard)
5- الخلاصة

1- مقدمة وتاريخ الكروماتوغرافيا:

لا شك أن طريقة الفصل الأكثر أهمية والأكثر استخدامًا هي طريقة “الكروماتوغرافيا”. تم اكتشاف الكروماتوغرافيا (Chromatography)من قبل عالم النبات الروسي المسمى تیسوت في أوائل القرن العشرين (1903). استخدم هذه التقنية لعزل أصباغ نباتية مختلفة مثل الكلوروفيل والزانثوفيل.يتم تصنيف الطرق الكروماتوغرافية على أساس مفهومين عامين: في الطريقة الأولى ، يعتمد الفصل على المفاهيم الفيزيائية ويتضمن مجموعتين من كروماتوغرافيا العمود(Column) وكروماتوغرافيا السطح.أساس التسمية في الفئة الثانية ، وهو الأكثر شيوعًا ، هو نوع الطور المتحرك ، والمرحلة الثابتة ، وأيضًا نوع التوازن الذي تم إنشاؤه بين المرحلتين. تتضمن هذه الفئة مجموعتين عامتين من الكروماتوغرافيا السائلة (الطور المتحرك سائل) وكروماتوغرافيا الغاز (مع الطور الغازي المتحرك).

2- المفاهيم الأساسية في الكروماتوغرافيا:

في جميع الطرق الكروماتوغرافية ، يتم الفصل على أساس الفرق في كمية المادة التحليلية (المادة المنفصلة) في مرحلتين (المرحلة الثابتة) Stationary Phase والمرحلة المتنقلة (الطور المتحرك) (Mobile Phase). يؤدي اختلاف القيمة هذا في النهاية إلى تكوين توازن ، يتم التعبير عنه بواسطة معلمة تسمى ثابت التوزيع (K). في هذا الصدد ، تشير Cm و Cs إلى التركيز المولي للتحليل في الطور المتحرك والمرحلة الثابتة ، على التوالي.
K=Cs/Cm (1)
أظهرت نتائج البحث أن الظواهر الفيزيائية والكيميائية المختلفة لها تأثير على سرعة الفصل وكذلك عرض النطاق الترددي المرئي لكل تحليل. من بين النظريات الموجودة التي تبرر وتحسب هذه العوامل ، تعتبر نظرية اللوحات الافتراضية(Plates) أكثر فائدة. في هذه النظرية ، يُفترض أن كل عمود يتكون من سلسلة من الطبقات الضيقة والأفقية والمنفصلة تمامًا ، والتي يتم وضعها بالتسلسل. كل من هذه الطبقات تسمى لوحة. في كل من هذه اللوحات ، يكون التحليل في حالة توازن بين الطور المتحرك والثابت ، وأخيراً ، تتم عملية الفصل عن طريق النقل بين الألواح. تعتمد كفاءة كل عمود على عدد اللوحات في العمود ، أو بعبارة أخرى ، عدد الأرصدة التي تم إنشاؤها في العمود. لذلك ، للتحقق من كفاءة العمود ، يقومون بحساب عدد اللوحات الافتراضية (N) من المعادلة التالية. في هذه العلاقة ، يُظهر H ارتفاع كل لوحة ويظهر L طول العمود.
N=L/H (2)
في هذه الموضوعات ، هناك العديد من المعلمات والتعريفات الأخرى من أجل حساب الكفاءة وظروف المختبر وأخيراً القياس الكمي للتحليل. لمزيد من المعلومات ، راجع المصدر رقم 1.

3- الكروماتوغرافيا السائل عالي الكفائه

من بين تقنيات الفصل ، الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء (High Performance Liquid Chromatography -HPLC)، التي تتمتع بأكبر قدر من النمو والكفاءة ، ويتم إنفاق ملايين الدولارات على شراء وبيع أجهزة HPLC في العالم كل عام. يمكن أن يُعزى سبب هذا النمو إلى الحساسية العالية ، والتحديد الكمي بدقة عالية ، والقدرة على تحليل العينات غير المتطايرة والحساسة لدرجة الحرارة غير الممكنة باستخدام تقنية GC (كروماتوغرافيا الغاز).

1-3- المرحلة الثابتة والمرحلة المتنقلة

هناك قاعدة عامة حول قطبية المراحل الثابتة والمتحركة. وفقًا لهذه القاعدة ، يجب أن تكون قطبية المذيب والطور المتحرك قريبين من بعضهما البعض ، لكنهما يختلفان عن المرحلة الثابتة. ترتيب قطبية المجموعات الوظيفية في المركبات على النحو التالي:

الهيدروكربون <الإيثرات <الإسترات <الكيتونات <الألدهيدات <الأميدات <الأمينات <الكحول

خصائص المرحلة المتنقلة في HPLC هي كما يلي:

• نسبة نقاوة عالية (المذيبات ذات نسبة نقاء عالية جداً ، HPLC Grade ، متوفرة في السوق ، والتي لها أيضاً سعر مرتفع)
• نقطة غليان أعلى من درجة حرارة العمود (خاصة في حالة العمل مع سخان(Oven))
• تفاعل منخفض (Inertness)
• القدرة على مطابقة الكاشف

2-3- مكونات وأجزاء مختلفة لجهاز HPLC

يشتمل جهاز HPLC ومعداته على أجزاء مختلفة مذكورة أدناه:
1- خزانات المذيبات: حيث يتم صب مذيبات الطور المتحرك أو مذيبات غسيل العمود.
2- المحرك أو المضخة: من أجل نقل المذيب وكذلك العينة في مساحة العمود الطويلة نسبيًا ، من الضروري إنشاء ضغط في النظام ، حيث يتم استخدام مضخة أو محرك واحد على الأقل. يتم تحريك المذيب (الطور المتحرك) بواسطة المضخة بسرعة ثابتة وتدفق في المرحلة الثابتة. يعتمد ضغط النظام على حجم الجسيمات في العمود واللزوجة (Viscosity) ومعدل تدفق الطور المتحرك. اعتمادًا على نوع الفصل ، يتم تحديد معدل تدفق الطور المتحرك. في الحالات التي نواجه فيها عددًا من التحليلات ، سيظهر كل نوع معزول نفسه على أنه ذروة في مخطط الكروماتوغرام النهائي. عند معدل تدفق منخفض للمرحلة المتنقلة ، ستزداد المسافة بين القمم وسيكون لدينا فصل أفضل. يقال عادة أنه في الأعمدة ذات القطر التقليدي (أقل من 5 مم/5mm)) ، يجب ألا يزيد معدل التدفق عن 2/5ml/min / دقيقة لأنه سيتلف العمود ويقلل من عمره الإنتاجي.
كمرحلة متحركة ، يمكن استخدام خليط من المذيبات بدلاً من مذيب نقي. قد تكون نسبة مكونات الطور المتحرك أثناء الحقن ثابتة ، وفي هذه الحالة تسمى طريقة (Isocratic). في حالة أخرى ، تسمى طريقة (Gradient)، أثناء الحقن ومع مرور الوقت ، وفقًا لبرنامج محدد مسبقًا للنظام ، يتم خلط نسبة مئوية مختلفة من مذيبين أو أكثر وتدفق في النظام بواسطة المضخة .

3- الحاقن (Injector): يتم حقن العينة يدويًا أو تلقائيًا ، حسب نوع الجهاز. في الطريقة الأوتوماتيكية ، تُسكب العينة في حاويات خاصة وتوضع في المكان المثبت بالجهاز. بعد أن يعطي المشغل أمر الحقن (عبر البرنامج) ، يتم نقل العينة إلى النظام بواسطة حقنة. في الطريقة اليدوية ، يتم استخدام الحقن ذات السعات المختلفة لحقن العينة. يعتمد حجم العينة المحقونة (في كلتا الطريقتين) على حجم حلقة أخذ العينات (Loop)وتتراوح قيمتها عادة بين 5 إلى 500 ميكرولتر. تدخل العينة أولاً هذه الحلقة وبعد تحضير النظام ، تدخل العمود مع الطور المتحرك.

4-العمود: بعد الحقن ، تدخل العينة أولاً جزءًا يسمى العمود الأولي(pre-column) أو عمود الحماية(Guard column). دور هذا العمود هو حماية العمود الرئيسي. عادة ما يكون طول هذا العمود حوالي السنتيمتر ومادته من الفولاذ المقاوم للصدأ. مادة التغليف(Packing) الخاصة بعمود الحماية الجنسية هي نفس مادة تعبئة العمود الرئيسي. يتميز تجانس نوع الحشو بأنه إذا كانت المادة التي تتفاعل مع جزيئات العمود موجودة في العينة ، فإنها محاصرة مبدئيًا في العمود الواقي ولا تلحق الضرر بالعمود الرئيسي. يبلغ طول الأعمدة الرئيسية للجهاز عادة حوالي 10-30 سم ويمتلئ الجزء الداخلي من العمود بمواد إما قشرية أو مسامية. يختلف حجم هذه الحشوات ، التي لها تأثير كبير على جودة الفصل ، وتتراوح عادة من 3 إلى 5 ميكرومتر.
يمكن أن يكون العمود قطبيًا أو غير قطبي. أحد أكثر الأعمدة غير القطبية شيوعًا هو C18 ، octadecyl silane (ODS). مادة الأعمدة من الفولاذ المقاوم للصدأ(Stainless Steel). بعد دخول العينة إلى العمود ، بناءً على الاختلاف في القطبية ، يتم فصل المكونات المختلفة للعينة عن بعضها البعض في أوقات مختلفة تسمى وقت الاحتفاظ(Retention Time) ويتم توجيهها إلى الكاشف(Detector) لاكتشاف نوع المادة.
أخيرًا ، بعد الانتهاء من العمل ، يتعين علينا غسل العمود. للغسيل ، اعتمادًا على نوع العمود ، نختار مذيبًا مختلفًا بترتيب معين. على سبيل المثال ، في الأعمدة غير القطبية ، بعد الانتهاء من العمل ، يتم أولاً غسل العمود بمذيب قطبي (عادةً ماء) ثم بمذيب غير قطبي (عادةً ميثانول).

5- الکاشف (Detector):
يتم اختيار الكاشف بناءً على نوع التحليل. بشكل عام ، يجب أن يتمتع الكاشف الجيد بالخصائص التالية:

• حساسية عالية
• غير مدمر(Nondestructive): لا تدمر العينة أثناء عملية تحديد الهوية.
• استجابة خطية للتركيز في نطاق واسع (لسهولة الحسابات)

في ما يلي ، تم ذكر عدد من أجهزة الكشف التقليدية:

الف- أحد أكثر أنواع أجهزة الكشف استخدامًا هو مقياس طيف الأشعة المرئية وفوق البنفسجية UV-Vis ، والذي يستخدم للأجسام التي تمتص في هذه المنطقة. في هذا الكاشف ، يتم قياس تركيز العينة باستخدام الفرق في معدل امتصاص العينة مع مصدر الضوء الأساسي وأخيراً باستخدام قانون بير لامبرت. في الحالات التي يتم فيها استخدام هذا الكاشف ، فإن اختيار الطول الموجي الصحيح هو أحد الأشياء التي يجب مراعاتها. عند الطول الموجي المختار ، يجب ألا يكون لديهم أي تداخلات في العينة وكذلك المذيب.

ب- كاشف معامل الانكسار: يعتمد أساس عمل هذا الكاشف على التغيرات في معامل الانكسار لنظام المذيب وحده ونظام المذيب مع العينة. تعتمد استجابة هذا الكاشف على درجة الحرارة وبالتالي نادرًا ما يتم استخدامه.

ج- كاشف التألق أكثر حساسية من كاشف الأشعة فوق البنفسجية / المرئية UV/Vis ، ولكن هناك القليل من المركبات التي لها خصائص التألق. نتيجة لذلك ، فإن تطبيق هذا الكاشف محدود أيضًا.

د- الكاشف الكهروكيميائي ، الذي يعتمد أداؤه على تفاعلات الأكسدة والاختزال ويتضمن طرق قياس التيار(Amperometry) ، وعلم الاستقطاب (Polarography)، وقياس الكولونيا (Coulometry) ، وطرق قياس الموصلية(Conductometry).

ه- كاشف مطياف الكتلة (MS): يستخدم هذا العنصر على نطاق واسع اليوم لما له من مزايا عديدة. من بينها ، يمكن أن نذكر الحد المنخفض للغاية للكشف (LOD) ، والحساسية العالية والانتقائية(Selectivity) ، وإمكانية فحص العينة في وجود تداخلات كيميائية.

إذا لم يكن من الممكن استخدام أي من هذه الحالات ، فسيتم استخدام الاشتقاق (إنشاء تغييرات كيميائية على العينة) لإنشاء عينة نشطة في كل من هذه الكواشف المذكورة. يوضح الشكل أدناه منظرًا لجهاز HPLC بمكوناته المختلفة [1].

الشكل 1- منظر لجهاز HPLC

4- المعلومات التي تم الحصول عليها من الكروماتوجرام

يظهر مثال كروماتوجرام في الشكل 2 ، حيث يتم فصل ثلاثة أنواع من السكريات عن بعضها البعض. يمكن استخلاص المعلومات الكمية وشبه الكمية والنوعية من مخطط الفولتاموجرام.

الشكل 2- نموذج على كروماتوجرام

1-4- التطبيقات النوعية

يتم إجراء التحليل النوعي لاكتشاف وتحديد نوع المركبات. نظرًا لأن وقت الاحتفاظ(Retention Time) لكل مادة في نظام ما وظروف المختبر المحددة ثابتة ومحددة ، يمكن استخدامها لتحديد نوع التحليل. لهذا الغرض ، تتم مقارنة مخطط الكروماتوجرام للتحليل مع مخطط الكروماتوجرام الذي تم الحصول عليه من معيار ذلك التحليل. إذا كان وقت التثبيط (Retention Time)هو نفسه ، فيمكن تحديد نوع المادة بشكل مؤكد. من الضروري الإشارة إلى أن هذه المقارنة بين هذين الكروماتوجرامين صالحة فقط في ظروف المختبر والأجهزة المتطابقة تمامًا.

2-4- التحليل الكمي

من أجل التحديد الكمي لكمية التحليل ، تتم مقارنة المنطقة الواقعة تحت ذروة أو ارتفاع ذروة المركب غير المعروف بالعينة القياسية. في الحالات التي تكون فيها القمم ضيقة ومتماثلة ، يكون قياس ارتفاع الذروة أكثر دقة وأسرع. على الرغم من أنه من السهل اليوم حساب الارتفاع والمساحة تحت الذروة بمساعدة الأجهزة الإلكترونية بدقة عالية ودقة. هناك طرق مختلفة لحساب القيمة المجهولة ، وبعض هذه الطرق مذكورة أدناه:

1-2-4- الطريقة القياسية الخارجية(External Standard)
في هذه الطريقة ، يتم عمل حلول بتركيزات مختلفة من المعيار (معيار التحليل المطلوب) ، ثم بناءً على الارتفاع أو المنطقة الواقعة أسفل الذروة التي تم الحصول عليها من مخطط كروماتوجرافي لهذه المعايير ، منحنى المعايرة (منحنى الارتفاع أو المنطقة تحت الذروة ، اعتمادًا على التركيز) باستخدام معادلة الخط الذي تم الحصول عليه أو قيمة الارتفاع أو المنطقة الواقعة أسفل ذروة العينة غير المعروفة ، يتم حساب المقدار الدقيق للتحليل.

2-2-4- طريقة الزیادة القياسية (Standard Addition)
في هذه الطريقة ، يتم أولاً تحليل المادة غير المعروفة ، ثم تُضاف أحجام محددة من المعيار إلى عدة حاويات تحتوي على نفس الكمية من العينة ، ويتم تحليل مخطط الكروماتوغرام المقابل لكل خطوة ، وأخيراً الارتفاع أو المنطقة الواقعة تحت الذروة من العينات يتم تحديدها على أساس الحجم القياسي. أخيرًا ، باستخدام العلاقات الحالية ، يمكن حساب تركيز العينة. يحافظ استخدام هذه الطريقة على نسيج ومصفوفة العينات ، ونتيجة لذلك ، يتم التخلص من إمكانية تداخل المصفوفة(Matrix Interference) في العينة بهذه الطريقة.

3-2-4- المعيار الداخلي(Internal Standard)
هناك نوعان من الأخطاء (النظامية والعشوائية) في النظام. يمكن إزالة بعض هذه المصادر الثابتة عن طريق إضافة معيار داخلي للعينات وتقسيم ارتفاع الذروة أو المنطقة الواقعة تحت الذروة لكل تحليل على نفس القيم للمعيار الداخلي. عند اختيار المعيار الداخلي ، يجب الانتباه إلى أوجه التشابه البنيوية بين المادة التحليلية والمكون المحدد ، وقرب وقت ذروة تثبيطها من ذروة العينة ، إلخ. باختيار معيار داخلي مناسب ، يمكن تقليل الخطأ من 1 إلى 2٪ إلى 5.0 إلى 1٪.

5-  خاتمة

يعتبر الکروماتوغرافی السائل عالي الأداء طريقة مناسبة لفصل وقياس وتحديد نوع المواد. هذه التقنية ، جنبًا إلى جنب مع طرق أخرى وأجهزة الكشف المتقدمة مثل مطياف الكتلة ، لها العديد من التطبيقات في مختلف العلوم. يعد اختيار المرحلة المتنقلة والثابتة واختيار الكاشف وتحديد معدل تدفق الطور المتحرك من بين الأشياء الأساسية في إعدادات طريقة HPLC المناسبة.

المصادر والمراجع

۱ – Skoog, D.A. “Principle of Instrumental Analysis”, 3nd Edition, USA: Saunders College Publishing, (1985).
۲ – Rouessac, F, Rouessac, A. “Chemical Analysis Modern Instrumentation MethodsTechniques” 2nd Edition, England, John Wiley & Sons Ltd, (2007).