تم تقسيم التمايز العظمي لMSCs in vitro إلى ثلاث مراحل:
تتكون المرحلة الأولى من الأيام الأربعة الأولى ، حيث تظهر ذروة (peak ) في عدد الخلايا. هذا هو تمايز الخلوي الأولی من اليوم الخامس إلى اليوم الرابع عشر ، والذي يتميز بنسخ البروتين الفوسفاتيز القلوي (ALP) والتعبير عنه. بعد هذه الذروة الأولی لـ ALP يبدأ مستواها في الانخفاض. وجد أيضًا في مرحلة مبكرة تعبيرًا عن مصفوفة من النوع الأول من الكولاجين والتي يترسب عليها المعدن (Quarles et al. 1992 ). تؤدي المرحلة الأخيرة من اليوم 14 إلى 28 إلى ظهور نسبة عالية من الأوستيوكالسين والأوستيوبونتين يليها ترسب الكالسيوم والفوسفات. تم قياس التمايز العظمي للخلايا الجذعية الوسيطة من خلال مراقبة نشاط الفوسفاتيز القلوي (ALP) وترسب الكالسيوم وعدد الخلايا.
Osteogenic differentiation التمايز العظمي
The osteogenic differentiation of MSCs in vitro has been divided into three stages:
The first stage consists of days one to four where a peak in the number of cells is seen. This is followed by early cell differentiation from days 5 to 14, which is characterised by the transcription and protein expression of alkaline phosphatase (ALP). After this initial peak of ALP its level starts to decline. Also found at an early stage is the expression of a collagen type I matrix onto which the mineral is deposited (Quarles et al., 1992). The final stage from days 14 to 28 results in a high expression of osteocalcin and osteopontin, followed by calcium and phosphate deposition Osteogenic differentiation of MSCs was quantified by monitoring alkaline phosphatase (ALP) activity, calcium deposition and cell number.
نشاط ALP activity
تم تقييم القدرة على تحفيز عظم السقالة عن طريق قياس نشاط ALP. ALP هو إنزيم يلعب دورًا رئيسيًا في عملية التمعدن عن طريق فصل مجموعات الفوسفات عن مصادر الفوسفات العضوية. نشاط ALP هو مؤشر أساسي لتكلس (calcification) مصفوفة العظام لأن نشاطها يبلغ ذروته قبل التمعدن. وهكذا ، يشير نشاط ALP إلى العملية الأولية لتمايز العظام
The osteoinductive ability of the scaffolds was evaluated by measuring ALP activity. ALP is an enzyme that plays a key role in the mineralization process by cleaving phosphate groups from organic phosphate sources. ALP activity is an early indicator of bone matrix calcification, since its activity peaks before mineralization. Thus, ALP activity is a marker of the initial process of osteogenic differentiation
staining by BCP/NBIT
تلطيخ بواسطة BCP/NBIT
Collagen deposition ترسب الكولاجين
تفرز بانيات العظم مصفوفة عضوية ، وهي طبقة كثيفة من الكولاجين تتناوب عموديًا بالتوازي مع محور حمل الإجهاد. في هذه المصفوفة ، تترسب معادن كثيفة للغاية أساسها هيدروكسيباتيت ، مدفوعة بالنقل النشط وغير النشط والتحكم في PH .
تلطيخ Picrosirius الأحمر هو طريقة شائعة لتصور الكولاجين الذي تفرزه الخلايا المزروعة في المختبر. كما أنها تستخدم كتقنية نسيجية لتصور الكولاجين في أقسام أنسجة البارافين. يظهر الكولاجين الملون تحت مجهر الضوء الأحمر.
The osteoblasts secrete the organic matrix, which are dense collagen layers that alternate parallel and orthogonal to the axis of stress loading. Into this matrix is deposited extremely dense hydroxyapatite-based mineral driven by both active and passive transport and pH control.
تلوين أحمرPicrosirius لمصفوفة الكولاجين
Picrosirius red staining of collagen matrix
ترسب الكالسيوم (التمعدن) Calcium deposition (Mineralization)
تتحرك بانيات العظم على مصفوفة العظام وترسب مزيجًا من البروتينات تسمىosteoids . يحتوي الستيرويد على بروتين يسمى الكولاجين كمكون رئيسي له. ثم تخزن بانيات العظم المعادن ، بما في ذلك الكالسيوم ، في العظم لبناء العظام.
يشيع استخدام تلطيخ الإيزارين الأحمر للكشف عن تكوين عقيدات الكالسيوم (التمعدن) التي تسببها بانيات العظم في المراحل النهائية من تمايز العظام في مزارع بانيات العظم. في وجود الكالسيوم ، يرتبط الإيزارين الأحمر بالكالسيوم ليشكل صبغة برتقالية إلى بحيرة حمراء ، والتي يمكن استخلاصها من صبغة ملطخة وقياسها.
Calcium deposition (Mineralization)
The osteoblasts move over the matrix of a bone and deposit a protein mixture called osteoid. The osteoid contains a protein called collagen as its major component. Then the osteoblasts deposit minerals including calcium into the osteoid to make bone.
تلطيخ الإيزارين الأحمر بالكالسيوم
Alizarin red staining of calcium
التکاثر الخلوي Cell proliferation
يعد تكاثر الخلايا وربطها وانتشارها خطوات أساسية للترجمة السريرية للسقالات ثلاثية الأبعاد لتطبيقات هندسة الأنسجة. alamarBlue عبارة عن كاشف تقييم بقاء الخلایا على قيد الحياة يحتوي على علامة زرقاء نفاذة وغير سامة وفلورية ضعيفة تسمى razorin.
يقيسAlamarBlue كميًا انتشار الخلايا البشرية والحيوانية والبكتيرية والفطرية والمتفطرة. إنه مفيد في اختبار السيتوكينات الحيوية ، وقياس حيوية الخلية ، وتحديد السمية الخلوية في المختبر وكذلك مراقبة نمو الخلايا.
Cell proliferation
Cell spreading, attachment, and proliferation are necessary steps towards the clinical translation of 3D scaffolds to be used for tissue engineering applications.
alamarBlue is a cell viability assay reagent which contains the cell permeable, non-toxic, and weakly fluorescent blue indicator dye called resazurin. alamarBlue quantitatively measures proliferation in human, animal, bacterial, fungal, and mycobacterial cells. It is useful for cytokine bioassays, cell viability assays, and in vitro cytotoxicity determinations as well as cell growth monitoring.
Cell attachment
ارتباط الخلية هو الخطوة الأولى في سلسلة من التفاعلات بين الخلية والمادة الحيوية ، وهو مهم للعمليات الخلوية مثل توجيه الخلية والتكاثر والتمايز
Cell attachment is the initial step in a cascade of cell–biomaterial interactions, and is important to cellular processes such as cell guidance, proliferation, and differentiation
