تشخيص وفحص جودة الزعفران باستخدام التحليل الكروماتوغرافي
نبات الزعفران يستخدم على نطاق واسع في التغذية والطب الإيراني. ونتيجة لذلك، فإن التحقق من جودتها وأصالتها أمر مهم للغاية. يعد مسحوق زهرة القرطم ومسحوق الكركم والصبار الأحمر(Aloevera) والتارترازين من أكثر الإضافات شيوعًا للزعفران. الزعفران عبارة عن مسحوق بني محمر أو أصفر ذهبي، يتحول إلى اللون الأصفر الفاتح في الماء. وسبب لونه هو وجود مركبين هما الكروسين (Crocin) والكروسيتين (crocetin). الطريقة الأكثر دقة لتحديد النقاء هي استخدام الطرق الكروماتوغرافية مثل GC/MS، HPLC وكروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة. وفي هذا المقال يتم التعريف بتطبيق كل من هذه الطرق ومزاياها وعيوبها. سوف تتعرف أيضًا على طرق أخرى للكشف عن شوائب الزعفران.
الزعفران هو نوع من التوابل يتم الحصول عليه من زهرة Crocus sativus. الزعفران نبات عمره قرون وينمو في الطبيعة والذي نما في الأصل من شرق البحر الأبيض المتوسط مع زهور الخريف ويعرف أيضًا بالزعفران البري وأصله آسيا الوسطى. لون الزعفران عادة ما يكون أصفر شاحب وبرتقالي فاتح. يتمتع الزعفران بطعم محايد نسبياً مع كمية قليلة من المرارة، وذلك بسبب وجود مادة تسمى Picrocrocin وصيغتها الكيميائية هی C6H26O7.
لون الزعفران
الزعفران عبارة عن مسحوق بني محمر أو أصفر ذهبي، يتحول إلى اللون الأصفر الشاحب في الماء. الكروسين (Crocin) والكروسيتين (crocetin) مادتان محددتان للون الزعفران. هاتان المادتان الصلبتان موجودتان في الزعفران بتركيز إجمالي يتراوح من 4 إلى 6%.
كروسين: الكروسين (Crocin) هو جليكوسيد أصفر برتقالي قابل للذوبان في الماء الساخن ونادرا ما يذوب في الكحول والجلسرين والبروبيلين غليكول ويذوب عند درجة حرارة 186 درجة مئوية.
كروسيتين: (crocetin) كروسيتين هو حمض ثنائي الكربوكسيل قابل للذوبان بشكل طفيف في الماء ومعظم المذيبات العضوية، ولكنه قابل للذوبان في البيريدين والقواعد العضوية المماثلة وكذلك في هيدروكسيد الصوديوم المخفف. يذوب كروستين عند 285 درجة مئوية.
الكروسين والكروستين هما المادتان اللتان تحددان لون الزعفران
الكروسين والكروستين هما المادتان اللتان تحددان لون الزعفران
تطبیق الكروماتوغرافيا في الكشف عن الزعفران الأصلي
يعد التحليل الكروماتوغرافي أحد أكثر الطرق شيوعًا المستخدمة للكشف الكمي والنوعي عن الشوائب الناتجة عن الأصباغ والأحماض القابلة للذوبان في الماء. وبما أن الزعفران يرتبط بشكل عام بإضافة الشوائب مثل الألوان الاصطناعية، فيمكن للطرق الكروماتوغرافية التعرف عليها بسهولة.
الطرق الكروماتوغرافية الأكثر شيوعًا المستخدمة لتقييم وتحديد الشوائب في الزعفران هي:
تحليل كروماتوغرافي سائل عالي الأداء (HPLC)
كروماتوغرافيا الغاز (GC)
كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة (TLC)
غالبًا ما يجمع الباحثون بين طرق كروماتوغرافية مختلفة وتقنيات وكاشفات أخرى لإنشاء تقنيات أكثر دقة وحساسية. مثل :
كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة (HPTLC): كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة عالية الأداء، وهي الشكل الأكثر تقدمًا من TLC، وبالتالي توفر الظروف اللازمة لفصل المواد بحساسية ودقة وكفاءة أعلى من TLC.
كروماتوغرافيا السوائل – التحليل الطيفي (LC-MS/MS): هي إحدى طرق تحليل العينات الصيدلانية والغذائية والبيولوجية والكيميائية الحيوية، وتستخدم بسبب قوتها وكفاءتها العالية. إمكانية التعرف وتحديد كمية الشوائب في العينات وهو ما لا يمكن تحقيقه من خلال طرق أخرى تتم بهذه الطريقة.
كروماتوغرافيا السائل (HPLC/PDA/MS): يوفر كاشف (detector) PDA الخاص بجهاز HPLC إمكانية الكشف في كامل الطيف في نفس الوقت أي أنه يتم تحديد النتائج بناء على الأبعاد الثلاثة للزمن وشدة الضوء والطول الموجي.
كروماتوغرافيا الغاز – مطياف الكتلة (GC/MS/MS): تستخدم هذه الطريقة لتحديد المواد الكيميائية المتطايرة. كما توفر هذه الطريقة معلومات حول نظير المادة.
كروماتوغرافيا الغاز-كاشف تأين اللهب (HS-GC-FID): طريقة كروماتوغرافيا الغاز مع كاشف تأين اللهب حساسة للغاية للمركبات العضوية ولها نطاق خطي واسع.
يعد كروماتوغرافيا السائل عالي الأداء (HPLC) تقنية قيمة لتحليل المكونات غير المتطايرة في الزعفران.
في طريقة HPLC، يتم إذابة العينة المطلوبة في مذيب غير قطبي (طور متحرك) مثل الكلوروفورم، الهكسان الحلقي (Cyclohexane)، إلخ. و ثم يمر عبر عمود رقیق مملوء بمذيب قطبي مثل الميثانول أو الأسيتونيتريل المعروف باسم الطور الثابت. ولكن في حالة عينات الطعام، من أجل تسريع التحليل، عادة ما يتم استخدام HPLC ذو الطور العكسي، أي أن الطور المتحرك عادة ما يكون قطبيًا بينما يظل الطور الثابت غير قطبي.
عادة ما تتم العمليات الكروماتوغرافية على أساس فصل مكونات الخليط بسرعات مختلفة. في طرق الفصل الكروماتوغرافي السائل، يعتمد فصل المواد على القطبية أو الشحنة الكهربائية أو الحجم الجزيئي للمكونات. تعتبر تقنية HPLC من أكثر الطرق الكروماتوغرافية استخداماً بين الطرق التحليلية للكشف عن الغش والشوائب وتحديد الزعفران الأصلي. أهم أجهزة الكشف المستخدمة في HPLC تشمل UV-vis وPDA وRI.
وفي السنوات الأخيرة، تم إحراز تقدم كبير في طرق الكشف عن الزعفران الأصلي باستخدام التحليل الكروماتوغرافي بحيث يمكن الكشف حتى عن أصغر كمية من الشوائب. يعد فصل المكونات المتطايرة (الكروماتوغرافيا للغاز) نوعًا آخر من الكروماتوغرافيا والذی مفيد جدًا. عادةً ما يتم استخدام تحليل كروماتوغرافيا الغاز (GC) جنبًا إلى جنب مع MS، ويتم استخدام كاشفات التحليل الطيفي بالأشعة تحت الحمراء لتحويل فورييه (FTIR) لتحسين دقة وحساسية الكشف عن الزعفران الأصلي. يتم الفصل في GC بناءً على التطاير وتقارب المكونات بالإضافة إلى ضغط بخار المركبات الموجودة. في هذه الطريقة، يكون الطور المتحرك عبارة عن غاز خامل مثل النيتروجين أو الهيدروجين، بينما قد يكون الطور الثابت عبارة عن سائل صلب أو لزج متصل بركيزة صلبة. لذلك، اعتمادًا على المرحلة الثابتة، يتم استخدام طريقتين:
كروماتوغرافيا الغاز- الصلب (GSC) وكروماتوغرافيا الغاز- السائل (GLC)
يعتبر كروماتوغرافيا الغاز أكثر فعالية بكثير من HPLC لتحديد مصدر الغش والشوائب في الزعفران والكشف عن الكروسين الاصطناعي والكروستين و Safranal. تم تحديد بعض الشوائب الهامة بما في ذلك مسحوق زهرة القرطم ومسحوق الكركم والصبار الأحمر(Aloevera) والتارترازين باستخدام طبقة رقيقة. وأظهرت الدراسات أن أقل درجة للكشف عن الشوائب في الزعفران كانت 2.59% للصبار، و4.15% للتارترازين، و31.01% لزهرة القرطم ، و41.98% للكركم. تم التعرف على شوائب القرطم والكركم بطريقة GC-MS/HSSPME. في هذه الدراسة، تم تحديد أدنى درجة للكشف عن الشوائب لزهرة القرطم والبکوریة الطبیة (نبات الآذريون) بنسبة 3% و2% على التوالي.
مزايا وعيوب استخدام طريقتين لكروماتوغرافيا الغاز (GC) وكروماتوغرافيا السائل ذات الأداء العالي (HPLC)
مزايا كروماتوغرافيا السائل ذات الأداء العالي (HPLC):
القدرة على التمييز بين المركبات المتطايرة وغير المتطايرة.
القدرة على التعرف على المركبات الأقل ثباتاً مقارنة بـ GC بسبب عدم تسخين العينات والأعمدة.
مزايا كروماتوغرافيا الغاز (GC):
دقة أفضل مع فصل أكثر وضوحًا من كروماتوغرافيا السائل (HPLC)
مناسب للكشف عن المواد المغشوشة شديدة التطاير في الزعفران مثل السافرانال الاصطناعي
كما أن التعرف على أصالة الزعفران بناءً على المنشأ الجغرافي (المكان الذي ینمو فيه نبات الزعفران) أفضل من الطرق الكروماتوغرافية الأخرى.
عيوب كروماتوغرافيا السائل ذات الأداء العالي (HPLC):
تستغرق العملية وقتًا طويلاً نظرًا للعدد الكبير من العينات التي سيتم إعدادها
إجراءات تحليل العينات الطويلة
دقة أقل مقارنة بطريقة GC
عيوب كروماتوغرافيا الغاز (GC):
من غير المناسب تحديد المركبات غير المتطايرة في الزعفران.
التكلفة العالية لتحليل العينات مقارنة بالطرق الكروماتوغرافية الأخرى المذكورة.
ويتطلب شخص خبير ومدرب.
طرق أخرى للكشف عن شوائب الزعفران وتحديد الزعفران الأصلي
الطرق الفيزيائية: إحدى الطرق الأساسية والبسيطة لتوفير المعلومات الأساسية حول نقاء الزعفران هي الطرق الفيزيائية. يمكن استخدام تقنيات مثل الشكل والذوق وقياس الألوان وأيضًا خصائص مثل الرطوبة والرماد. كما يعد استخدام الأدوات المجهرية في تحديد الشوائب في الزعفران إحدى الطرق الفيزيائية. يعد غمر خيوط الزعفران في الماء مثالاً على الطريقة الفيزيائية. في هذه الطريقة البسيطة، يتحول الزعفران الأصلي ببطء إلى اللون البرتقالي الفاتح أو الأصفر في الماء. لكن الزعفران المزيف لا يطلق اللون أو يعطي اللون على الفور.
الطرق والتقنيات الكيميائية والبيوكيميائية: تم تقديم تقنيات كيميائية وبيوكيميائية مختلفة لتمييز الزعفران الأصلي عن النوع غير النقي، بما في ذلك الکروماتوغرافیا والتحليل الطيفي. وعلى الرغم من أن هذه الطرق أكثر دقة وحساسية وتحديدًا من الطرق الفيزيائية، إلا أن تحليل العينات مكلف ويتطلب خبیر متدرب.
تقنيات التحليل الطيفي: التحليل الطيفي هو دراسة البيانات الطيفية الناتجة عن تفاعل الإشعاع الكهرومغناطيسي مع العينة، والذي يتضمن ثلاثة أشكال من التفاعلات الناتجة عن إشعاع الموجات الكهرومغناطيسية، وهي: الإمتصاص والنقل و التحليل الطيفي للتشتت.
التقنيات المعتمدة علی الجزيئات و التقنيات المعتمدة علی DNA: نظرًا لاستقرار السمات الجينية (DNA) في الأنواع النباتية والحيوانية منذ الولادة وحتى الوفاة، فإن التقنيات الجزيئية مناسبة للكشف عن الاحتيال البيولوجي.
تقنيات استشعار الغذاء: المستشعر هو في الأساس نوع من محولات الطاقة التي يمكنها قياس بعض التغيرات والمعلمات الفيزيائية والكيميائية والبيولوجية مثل درجة الحرارة والرطوبة النسبية و pH. بعد اكتشاف التغييرات، تقوم المستشعرات بإرسال النتيجة كإشارة خرج تتعلق بالتغييرات. تتوفر أنواع مختلفة من أجهزة الاستشعار في السوق، مثل أجهزة الاستشعار البصرية، وأجهزة الاستشعار القائمة على البوليمر، وأجهزة استشعار الغاز، وأجهزة الاستشعار الكهروكيميائية و أجهزة استشعار الألوان ، ومحولات الطاقة الكهربائية، التي تعتبر مثالية للتطبيقات الغذائية لأنها سريعة وغير مكلفة، ويمكن دمجها في الغذاء. في الواقع، تعد أجهزة الاستشعار أدوات قوية وأكثر تحديدًا بكثير من أنظمة الكشف مثل الکروماتوغرافیا والتحليل الطيفي. يمكن لهذه التقنيات تحديد جميع أنواع الغش والشوائب في الأغذية ويمكنها تحديد الشوائب بسرعة مع الحد الأدنى من تركيز العينة.
